Técnica de hibridación: Microarrays

 Detección del grupo de genes de cepas ΔIon y ΔIon rpoB12 de Escherichia coli mediante Microarrays

La mutación rpoB12 se aisló espontáneamente en fondo de la cepa ΔIon. Las cepas de E. coli se cultivaron en un medio LB a 30 °C durante la noche por duplicado. Luego se aisló el ARN total de cada muestra y se estudiaron y compararon los perfiles de transcriptomas basados en microarrays.

Pasos a realizar para la técnica:

1. Etiquetado y preparación: Se transcribieron inversamente 500 ng de cada ARN a 40 °C usando cebadores de haxámero y cebador oligo-dT, se usó las moléculas de ADNc de doble cadena sintetizadas como molde para generación de ARNc.

2. Hibridación: Con la utilización del kit de hibridación in situ basado en sondas de expresión génica, se fragmentaron 1000ng de muestra de ARNc marcada a 60°C y se hibridaron con una E. coli _8x15K de diseño genotípico a 65 °C durante 16 h.

3. Escaneo: Lavado de portaobjetos hibridados con tampones de lavado Agilent y fueron escaneados con el escáner de microarrays Agilent.

Interpretación de resultados

Únicamente resultado cualitativo: Se identificaron genes significativos asociados con la mutación rpoB12 (His526Tyr) regulados hacia arriba y hacia abajo en las muestras de prueba con respecto a la muestra de control.

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Bibliografía

1.

Shanmugaraja Meenakshi & M. Hussain Munavar. Datos de perfil de transcriptoma basados en microarrays de cepas ΔIon y ΔIon rpoB12 de Escherichia coli. Biblioteca Nacional de Medicina de EE.UU. PubMed [Internet].; 2018 [citado el 9 de Enero de 2022. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6202797/

PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)

 Detección de Bordetella pertussis mediante una PCR en tiempo real con cuatro objetivos

Tras la extracción de ácido nucleico, se realizaron dos PCR multiplex diferentes para la detección de IS 418 e IS 1001, y otra para a detección de recA e IS 1002.

Pasos a realizar

1. Inicio: En cada PCR se utilizó una mezcla de reacción de 50 μL que consta de 0,3 μM de cada uno de los cebadores, 0,2 μM de cada una de las sondas y 5,0 ml del NA extraído.

2. La amplificación se realizó en el sistema de PCR LightCycler 480 II y su perfil térmico consistió en un ciclo de 3 minutos a 95°C, seguido de 45 ciclos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C.

3. Fluorescencia: fue adquirido durante cada ciclo y se incluyó una etapa de enfriamiento final de 30 segundos a 40 ° C.

Interpretación de resultados  

Precisión: Todas las cepas clínicas y cepas de referencia fueron correctamente identificadas: Las cepas de pertussis fueron positivas para IS 481 e IS 1002, y negativas para recA e IS 1001. 

Especificidad: El análisis BLAST mostró que IS 481 e IS 1002 puede reaccionar de forma cruzada con B. bronchiseptica y B. holmesii y recA mostró reactividad cruzada con algunas Burkhoderia spp.

3. 

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Bibliografía

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1.

Martini Helena, Detemmerman, Soetens Oriane, Yusuf Erlangga, Piérard Denis. Mejora de la especificidad de la detección de Bordetella pertussis mediante una PCR en tiempo real de cuatro objetivos. Biblioteca Nacional de Medicina de EE.UU. PubMed [Internet].; 2017 [citado el 26 de Diciembre de 2021. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5389834/

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Extracción de Ácido Nucleico

 Pasos básicos para la extracción de ácido nucleico

Proceso de extracción de ácido nucleico a partir de una muestra de aspirado nasal en fase sólida para la detección de Bordetella pertussis, procesada mediante dispositivos de microfluidos (1): 

1. Lisis de la membrana celular por medio de lisis química con detergente SPE.

2. Separación por centrifugación por 5 min, combinada con etanol al 70% para precipitar el ácido nucleico.

3. Purificación en chip usando perlas de sílice o magnéticas, en dónde, se compactaron perlas de sílice de tamaños que variaban de 5 µm a 30 µm contra el vertedero grabado aplicando vacío para la extracción de ácido nucleico.

4. Amplificación por PCR y análisis electroforético en un microchip híbrido de vidrio/PDMS. 

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Bibliografía

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1.

Rajesh Paul, Ostermann Emily, Qingshan Wei. Avances en tecnologías de extracción de ácido nucleico en el punto de atención para el diagnóstico rápido de enfermedades humanas y vegetales. Biblioteca Nacional de Medicina de EE.UU. PubMed [Internet].; 2020 [citado el 18 de Diciembre de 2021. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7476893/

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Bioseguridad en el laboratorio de Biología Molecular

 Tres normas básicas de bioseguridad en el laboratorio de Biología Molecular

1. Es obligatoria la utilización de elementos de protección como: bata de laboratorio, guantes, gorro desechable y en el caso de las mujeres el cabello lo tendrán recogido, gafas de seguridad, máscaras para gases y zapatos con suela antideslizante (1).

2. Para prevenir salpicaduras no se debe mirar por la boca del tubo de ensayo o matraz ni pipetear con la boca, y en caso de presentarse, se debe limpiar de inmediato empleando el equipo de seguridad adecuado además de informar al coordinador (1).

3. Lavarse las manos con agua y jabón antes y después de la práctica, manejo adecuado de desechos y dejar limpio y seco el material y puesto de trabajo al terminar la práctica (2).

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Bibliografía

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1.	Martínez I. Nataly V., Peñafiel M. Carlos I. Mgs. Manual de bioseguridad para los laboratorios clínicos de Microbiología, Citología y Biología Molecular. Universidad Nacional de Chimborazo, 2018. Facultad de Ciencias de la Salud [Internet].; 2019 [citado el 11 de Diciembre de 2021. Disponible en: http://dspace.unach.edu.ec/bitstream/51000/5562/1/UNACH-EC-FCS-LAB-CLIN-2019-0012.pdf
2.	Universidad de San Martín de Porres. Protocolo de seguridad y bioseguridad de laboratorios en la Facultad de Medicina Humana. Universidad de San Martín de Porres. Facultad de Medicina Humana [Internet].; 2019 [citado el 11 de Diciembre de 2021. Disponible en: https://medicina.usmp.edu.pe/images/servicios/SubComite_Seguridad/Bioseguridad-2019.pdf

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Mi nombre es Shirley Vite, estudiante de la carrera de Medicina de la Universidad Central del Ecuador. Sean todos bienvenidos a mi blog, el objetivo de este espacio virtual es brindar información acorde a los temas correspondientes a la Cátedra de Biología Celular y Molecular, e implementar recomendaciones afines a esta carrera. Espero que este contenido sea de gran utilidad y que el deseo de alcanzar nuestra tan anhelada profesión se convierta en una realidad. ¡Muchas gracias!

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